免费的毛片网站,大又大粗又爽又黄少妇毛片,久久免费国产视频,菠萝蜜视频网在线www

當前位置: 首頁 > 飛機專利

飛機技術發(fā)展歷程小約翰(飛機技術發(fā)展歷程pdf)

作者:admin 發(fā)布時間: 2023-04-01 22:02:07

簡介:】一、厭氧發(fā)酵技術發(fā)展歷程?厭氧發(fā)酵是指廢棄物在厭氧條件下通過微生物的代謝活動而被穩(wěn)定化,同時伴有甲烷和CO2產生的變化,液化階段主要是發(fā)酵細菌起作用,包括纖維素分解菌和蛋

一、厭氧發(fā)酵技術發(fā)展歷程?

厭氧發(fā)酵是指廢棄物在厭氧條件下通過微生物的代謝活動而被穩(wěn)定化,同時伴有甲烷和CO2產生的變化,液化階段主要是發(fā)酵細菌起作用,包括纖維素分解菌和蛋白質水解菌。

原理

液化階段主要是發(fā)酵細菌起作用,包括纖維素分解菌和蛋白質水解菌,產酸階段主要是醋酸菌起作用,產甲烷階段主要是甲烷細菌,他們將產酸階段產生的產物降解成甲烷和CO2同時利用產酸階段產生的氫將CO2還原成甲烷

厭氧發(fā)酵

厭氧發(fā)酵是指廢棄物在厭氧條件下通過微生物的代謝活動而被穩(wěn)定化,同時伴有甲烷和CO2產生的變化,液化階段主要是發(fā)酵細菌起作用,包括纖維素分解菌和蛋白質水解菌。

影響

厭氧發(fā)酵的影響因素有:原料配比,厭氧發(fā)酵的碳氮比以20-30為宜,當碳氮比在35時產期量明顯下降;溫度在35-40℃為宜;pH值對于甲烷細菌來說,維持弱堿環(huán)境是絕對必要的,它的最佳pH范圍為6.8-7.5,pH值低,它使CO2大增,大量水溶性有機物和H2S產生,硫化物含量的增加抑制了甲烷菌的生長,可以加石灰調節(jié)pH,但是調整pH的最好方法是調整原料的碳氮比,因為底質中用以中和酸的堿度主要是氨氮,底質含氮量越高,堿度越大,當VFA(揮發(fā)性脂肪酸)>3000時,反應會停止。

作用

利用厭氧微生物的轉化作用,將垃圾中大部分可生物降解的有機物質進行分解,轉化為沼氣的處理方式。

優(yōu)點

厭氧發(fā)酵是一種成熟的垃圾能源化技術,將垃圾轉化成沼氣后,便于輸送和儲存,熱值高,燃燒污染小,用途廣泛。

二、農業(yè)技術發(fā)展歷程?

我國農業(yè)科技創(chuàng)新體系從中央到地方層級架構完整,機構數(shù)量、人員規(guī)模、產業(yè)和學科覆蓋面均為全球之最。

在科研體系建設方面,在新中國成立前的北京、淮安、保定、濟南等幾個農業(yè)試驗場的基礎上,迅速建立了中央、省、地三級農業(yè)科研機構系統(tǒng)。

改革開放迎來了科學技術事業(yè)發(fā)展的春天,政策環(huán)境、制度環(huán)境和投入支持環(huán)境得到了較大改善。

三、電子封裝技術發(fā)展歷程?

第一階段(20世紀70年代之前)

以通孔插裝型封裝為主;典型的封裝形式包括最初的金屬圓形(TO型)封裝,以及后來的陶瓷雙列直插封裝(CDIP)、陶瓷-玻璃雙列直插封裝(Cer DIP)和塑料雙列直插封裝(PDIP)等;其中的PDIP,由于其性能優(yōu)良、成本低廉,同時又適于大批量生產而成為這一階段的主流產品。

第二階段(20世紀80年代以后)

從通孔插裝型封裝向表面貼裝型封裝的轉變,從平面兩邊引線型封裝向平面四邊引線型封裝發(fā)展。表面貼裝技術被稱為電子封裝領域的一場革命,得到迅猛發(fā)展。與之相適應,一些適應表面貼裝技術的封裝形式,如塑料有引線片式裁體(PLCC)、塑料四邊引線扁平封裝(PQFP)、塑料小外形封裝(PSOP)以及無引線四邊扁平封裝(PQFN)等封裝形式應運而生,迅速發(fā)展。其中的PQFP,由于密度高、引線節(jié)距小、成本低并適于表面安裝,成為這一時期的主導產品。

第三階段(20世紀90年代以后)

半導體發(fā)展進入超大規(guī)模半導體時代,特征尺寸達到0.18-0.25μm,要求半導體封裝向更高密度和更高速度方向發(fā)展。因此,半導體封裝的引線方式從平面四邊引線型向平面球柵陣列型封裝發(fā)展,引線技術從金屬引線向微型焊球方向發(fā)展。

在此背景下,焊球陣列封裝(BGA)獲得迅猛發(fā)展,并成為主流產品。BGA按封裝基板不同可分為塑料焊球陣列封裝(PBGA),陶瓷焊球陣列封裝(CBGA),載帶焊球陣列封裝(TBGA),帶散熱器焊球陣列封裝(EBGA),以及倒裝芯片焊球陣列封裝(FC-BGA)等。

為適應手機、筆記本電腦等便攜式電子產品小、輕、薄、低成本等需求,在BGA的基礎上又發(fā)展了芯片級封裝(CSP);CSP又包括引線框架型CSP、柔性插入板CSP、剛性插入板CSP、園片級CSP等各種形式,目前處于快速發(fā)展階段。

同時,多芯片組件(MCM)和系統(tǒng)封裝(SiP)也在蓬勃發(fā)展,這可能孕育著電子封裝的下一場革命性變革。MCM按照基板材料的不同分為多層陶瓷基板MCM(MCM-C)、多層薄膜基板MCM(MCM-D)、多層印制板MCM(MCM-L)和厚薄膜混合基板MCM(MCM-C/D)等多種形式。SiP是為整機系統(tǒng)小型化的需要,提高半導體功能和密度而發(fā)展起來的。

SiP使用成熟的組裝和互連技術,把各種集成電路如CMOS電路、GaAs電路、SiGe電路或者光電子器件、MEMS器件以及各類無源元件如電阻、電容、電感等集成到一個封裝體內,實現(xiàn)整機系統(tǒng)的功能。

目前,半導體封裝處于第三階段的成熟期與快速增長期,以BGA/CSP等主要封裝形式開始進入規(guī)模化生產階段。同時,以SiP和MCM為主要發(fā)展方向的第四次技術變革處于孕育階段。

四、分子鑒定技術發(fā)展歷程?

分子診斷技術是指以DNA和RNA為診斷材料,用分子生物學技術通過檢測基因的存在、缺陷或表達異常,從而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的技術。其基本原理是檢測DNA或RNA的結構是否變化、量的多少及表達功能是否異常,以確定受檢者有無基因水平的異常變化,對疾病的預防、預測、診斷、治療和預后具有重要意義。通俗簡單的講所有基于分子生物學水平的方法學技術都屬于分子診斷技術,比如PCR技術、基因測序技術等等。

PCR技術即聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,基本原理類似于DNA的天然復制過程,由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:模板DNA的變性,模板DNA與引物的退火(復性),引物的延伸。重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。由1983年美國Mullis首先提出設想,1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應,即簡易DNA擴增法,意味著PCR技術的真正誕生。簡單講PCR技術本質上是針對DNA片段進行擴增放大,通過實時熒光PCR技術使得樣本中DNA含量可以檢測出來。

基因測序技術即測定DNA序列的技術。在分子生物學研究中,DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger等(1977)發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和 Gilbert(1977)發(fā)明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大,但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始,隨機在某一個特定的堿基處終止,產生 A,T,C,G四組不同長度的一系列核苷酸,然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測,從而獲得DNA序列。目前 Sanger測序法得到了廣泛的應用。簡單講基因測序技術是針對DNA片段進行測序和分析,使得DNA序列得以清晰。

下面一起來了解一下分子診斷技術近50年的發(fā)展歷程:

一、基于分子雜交的分子診斷技術

上世紀60年代至80年代是分子雜交技術發(fā)展最為迅猛的20年,由于當時尚無法對樣本中靶基因進行人為擴增,人們只能通過已知基因序列的探針對靶序列進行捕獲檢測。其中液相和固相雜交基礎理論、探針固定包被技術與cDNA探針人工合成的出現(xiàn),為基于分子雜交的體外診斷方法進行了最初的技術儲備。

(一)DNA印跡技術(Southern blot)

Southern[1]于1975年發(fā)明了DNA印跡技術,通過限制性內切酶將DNA片段化,再以凝膠電泳將長度不等的DNA片段進行分離,通過虹吸或電壓轉印至醋酸纖維膜上,再使膜上的DNA變性與核素標記的寡核苷酸探針進行分子雜交,經洗脫后以放射自顯影鑒別待測的DNA片段-探針間的同源序列。這一方法由于同時具備DNA片段酶切與分子探針雜交,保證了檢測的特異性。因此,一經推出后便成為探針雜交領域最為經典的分子檢測方法,廣為運用于各種基因突變,如缺失、插入、易位等,及與限制性酶切片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鑒定中。Alwine等[2]于1977年推出基于轉印雜交的Northern blot技術也同樣成為當時檢測RNA的金標準。

(二)ASO反向斑點雜交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)

使用核酸印跡技術進行核酸序列的雜交檢測具有極高的特異性,但存在操作極為繁瑣,檢測時間長的缺點。1980年建立的樣本斑點點樣固定技術則擺脫了傳統(tǒng)DNA印跡需要通過凝膠分離技術進行樣本固定的缺點。通過在質粒載體導入單堿基突變的方法,構建了首條等位基因特異性寡核苷酸探針(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使對核酸序列點突變的檢測成為可能。1986年,Saiki[3]首次將PCR的高靈敏度與ASO斑點雜交的高特異性結合起來,實現(xiàn)了利用ASO探針對特定基因多態(tài)性進行分型。其后為了完成對同一樣本的多個分子標記進行高通量檢測,Saiki[4]又發(fā)明了ASO-RDB,通過將生物素標記的特異性PCR擴增產物與固定于膜上的探針雜交顯色,進行基因分型、基因突變的檢測。該法可將多種寡核苷酸探針固定于同一膜條上,只需通過1次雜交反應,即可篩查待檢樣本DNA的數(shù)十乃至數(shù)百種等位基因,具有操作簡單、快速的特點,一度成為基因突變檢測、基因分型與病原體篩選最為常用的技術。

(三)熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)

FISH源于以核素標記的原位雜交技術,1977年Rudkin[5]首次使用熒光素標記探針完成了原位雜交的嘗試。在上世紀8090年代,細胞遺傳學和非同位素標記技術的發(fā)展將FISH推向臨床診斷的實踐應用。相比于其它僅針對核酸序列進行檢測的分子診斷技術,FISH結合了探針的高度特異性與組織學定位的優(yōu)勢,可檢測定位完整細胞或經分離的染色體中特定的正?;虍惓NA序列;由于使用高能量熒光素標記的DNA探針,可實現(xiàn)多種熒光素標記同時檢測數(shù)個靶點。

如今,FISH已在染色體核型分析,基因擴增、 基因重排、病原微生物鑒定等多方面中得到廣泛應用。通過比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CGH)與光譜核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技術,使其正在越來越多的臨床診斷領域中發(fā)揮作用。

(四)多重連接探針擴增技術(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)

MLPA技術于2002年由Schouten等[6]首先報道。每個MLPA探針包括2個熒光標記的寡核苷酸片段,1個由化學合成,1個由M13噬菌體衍生法制備;每個探針都包括1段引物序列和1段特異性序列。在MLPA反應中,2個寡核苷酸片段都與靶序列進行雜交,再使用連接酶連接2部分探針。連接反應高度特異,只有當2個探針與靶序列完全雜交,連接酶才能將2段探針連接成1條完整的核酸單鏈;反之,如果靶序列與探針序列不完全互補,即使只有1個堿基的差別,就會導至雜交不完全,使連接反應無法進行。連接反應完成后,用1對熒光標記的通用引物擴增連接好的探針,每個探針擴增產物的長度都是唯一的。最后,通過毛細管電泳分離擴增產物,便可對把核酸序列進行檢測。由于巧妙地借鑒了擴增探針的原理,MLPA技術最多可在1次反應中對45個靶序列的拷貝數(shù)進行鑒定。

該技術具備探針連接反應的特異性與多重擴增探針雜交的高通量特性。經過MRC-Holland公司10余年的發(fā)展,MLPA技術已成為涵蓋各種遺傳性疾病診斷、藥物基因學多遺傳位點鑒定、腫瘤相關基因突變譜篩查、DNA甲基化程度定量等綜合分子診斷體系,是目前臨床最為常用的高通量對已知序列變異、基因拷貝數(shù)變異進行檢測的方法。

(五)生物芯片

1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研發(fā)的光蝕刻技術制備了首個以玻片為載體的微陣列,標志著生物芯片正式成為可實際應用的分子生物學技術。時至今日,芯片技術已經得到了長足的發(fā)展,如果按結構對其進行分類,基本可分為基于微陣列(microarray)的雜交芯片與基于微流控(microfluidic)的反應芯片2種。

1.微陣列芯片

(1)固相芯片:微陣列基因組DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:將微陣列技術應用于MGDP檢測中已有超過十年的歷史,其技術平臺主要分為2類,即微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型雜交陣列(SNP array)。顧名思義,aCGH芯片使用待測DNA與參比DNA的雙色比對來顯示兩者間的拷貝數(shù)變異(CNV)的變化,而單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片則無需與參比DNA進行比較,直接通過雜交信號強度顯示待測DNA中的SNP信息。隨著技術的不斷進步,目前市場上已出現(xiàn)可同時檢測SNP與CNV的高分辨率混合基因陣列芯片。MGDP芯片主要應用于發(fā)育遲緩、先天性異常畸形等兒童遺傳病的輔助診斷及產前篩查。經驗證,使用MGDP芯片進行染色體不平衡檢測與FISH的診斷符合率可達100%[8],表達譜芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片繪制了mRNA表達譜信息。隨著表觀遺傳學在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益得到重視,目前也已出現(xiàn)microRNA芯片、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。類似于MGDP芯片,GEP芯片使用反轉錄后生成的cDNA文庫與固定于芯片載體上的核酸探針進行雜交,從而檢測雜交熒光信號的強度判斷基因的表達情況。相較于基因組雜交,GEP芯片對生物學意義更為重要的轉錄組信息進行檢測,對疾病的診斷與預后判斷具有特殊的意義。目前使用GEP芯片對急性髓細胞白血病、骨髓增生異常綜合征等血液病及神經退行性變等進行診斷、分類及預后評估已經獲得了令人滿意的效果;

(2)液相芯片:傳統(tǒng)固相芯片將檢測探針錨定于固相載體上捕獲目的序列,而Luminex公司的xMAP技術[10]則通過搭配不同比例的2種紅色熒光染料,將聚苯乙烯微球標記為不同的熒光色,并對其進行編碼得到具有上百種熒光編號的微球。通過xTAG技術將不同的特異性雜交探針交聯(lián)至編碼微球上,使得不同的探針能夠通過微球編碼得以區(qū)分。利用混合后的探針-微球復合物與待測樣本進行雜交,使微球在流動鞘液的帶動下通過紅綠雙色流式細胞儀,其中紅色激光檢測微球編碼,綠色熒光檢測經雜交后核酸探針上熒光報告基團的信號強度,一次完成對單個樣本中多種靶序列的同時鑒定。目前,該技術已在囊性纖維化等遺傳性疾病診斷、多種呼吸道病毒鑒定及人乳頭瘤病毒分型取得了廣泛的應用。

2.微流控芯片

1992年Harrison等[11]首次提出了將毛細管電泳與進樣設備整合到固相玻璃載體上構建“微全分析系統(tǒng)”的構想,通過分析設備的微型化與集成化,完成傳統(tǒng)分析實驗室向芯片上實驗室(lab-on-chip)的轉變。微流控芯片(microfluidic chip)由微米級流體的管道、反應器等元件構成,與宏觀尺寸的分析裝置相比,其結構極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比,以最大限度利用液體與物體表面有關的包括層流效應、毛細效應、快速熱傳導和擴散效應在內的特殊性能,從而在1張芯片上完成樣品進樣、預處理、分子生物學反應、檢測等系列實驗過程。

目前使用微流控芯片進行指導用藥的多基因位點平行檢測是主要臨床應用領域。

二、核酸序列測定

測序反應是直接獲得核酸序列信息的唯一技術手段,是分子診斷技術的一項重要分支。雖然分子雜交、分子構象變異或定量PCR技術在近幾年已得到了長足的發(fā)展,但其對于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設上,因此對基于特定基因序列檢測的分子診斷,核酸測序仍是技術上的金標準。

(一)第1代測序

1975年Sanger與Coulson發(fā)表了使用加減法進行DNA序列測定的方法,隨后Maxam在1977年提出了化學修飾降解法的模型,為核酸測序時代的來臨拉開了序幕。

Sanger等于同年提出的末端終止法(Sanger測序法)利用2'與3'不含羥基的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)進行測序引物延伸反應,ddNTP在DNA合成反應中不能形成磷酸二酯鍵,DNA合成反應便會終止。如果分別在4個獨立的DNA合成反應體系中加入經核素標記的特定ddNTP,則可在合成反應后對產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自顯影,根據(jù)電泳條帶確定待測分子的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基礎上,于1986年推出了首臺商業(yè)化DNA測序儀PRISM 370A,并以熒光信號接收和計算機信號分析代替了核素標記和放射自顯影檢測體系。該公司于1995年推出的首臺毛細管電泳測序儀PRISM 310更是使測序的通量大大提高。Sanger測序是最為經典的一代測序技術,仍是目前獲取核酸序列最為常用的方法。

(二)第2代測序

1.焦磷酸測序(Pyro-sequencing)

不同于Sanger測序法所使用的合成后測序理念,Ronaghi分別于1996年與1998年提出了在固相[13]與液相[14]載體中通過邊合成邊測序的方法-焦磷酸測序。其基本原理是利用引物鏈延伸時所釋放的焦磷酸基團激發(fā)熒光,通過峰值高低判斷與其相匹配的堿基數(shù)量。由于使用了實時熒光監(jiān)測的概念,焦磷酸測序實現(xiàn)了對特定位點堿基負荷比例的定量,因此在SNP位點檢測、等位基因(突變)頻率測定、細菌和病毒分型檢測方面應用廣泛。由于熒光報告原理不同,其對于序列變異的檢測靈敏度從Sanger測序的20%提高到了5%。但由于該技術的儀器采購與單次檢測成本較高,目前尚未得到大規(guī)模的臨床使用。

2.高通量第2代測序

目前常見的高通量第二代測序平臺主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均為通過DNA片段化構建DNA文庫、文庫與載體交聯(lián)進行擴增、在載體面上進行邊合成邊測序反應,使得第1代測序中最高基于96孔板的平行通量擴大至載體上百萬級的平行反應,完成對海量數(shù)據(jù)的高通量檢測。該技術可以對基因組、轉錄組等進行真正的組學檢測,在指導疾病分子靶向治療、繪制藥物基因組圖譜指導個體化用藥、感染性疾病的病原微生物宏基因組鑒定及通過母體中胎兒DNA信息進行產前診斷等方面已經取得了喜人的成績。然而,由于該技術需要對DNA進行片段化處理,測序反應讀長較短(如Solexa與SOLiD系統(tǒng)單次讀長僅50bp),需要對數(shù)據(jù)進行大規(guī)模拼接,因此對分子診斷工作者掌握生物信息學知識提出了更高要求,以利于后期的測序數(shù)據(jù)分析。

(三)第3代測序

第3代測序技術的核心理念是以單分子為目標的邊合成邊測序。該技術的操作平臺目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔技術等。該技術進一步降低了成本,可對混雜的基因物質進行單分子檢測,故對SNP、CNV的鑒定更具功效。但是目前其進入產品商業(yè)化,并最終投入臨床應用仍有很長的距離。

三、基于分子構象的分子診斷技術

(一)變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)與單鏈構象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism,SSCP)

1970~1980年間,Fischer等[15]與Orita等[16]分別提出了利用核酸序列變異所導至雙鏈變性條件差異與單鏈空間折疊差異,通過變性與非變性PAGE對變異序列進行分離鑒定的方法,即DGGE與SSCP。上述2項技術均通過變異核酸分子在空間構象上的差異,通過特定條件下電泳速率的變化進行檢測。正因為核酸分子構象具有序列特異性,且對于序列的改變非常敏感,常常1個堿基的變化也能得到鑒定。但由于DGGE與SSCP均必須進行PCR后開蓋電泳的操作,現(xiàn)已不常見于臨床檢測。

(二)變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)

1997年,Oefner和Underhill建立[17,18]了利用異源雙鏈變性分離變異序列、使用色譜洗脫鑒定的技術,稱為dHPLC,可自動檢測單堿基置換及小片段核苷酸的插入或缺失。對于存在一定比例變異序列的核酸雙鏈混合物,其經過變性和復性過程后,體系內將出現(xiàn)2種雙鏈:一種為同源雙鏈,由野生正義鏈-野生反義鏈或變異正義鏈-變異反義鏈構成的核酸雙鏈;另一種為異源雙鏈,即雙鏈中1條單鏈為野生型,而另1條為變異型。由于存在部分堿基錯配的異源雙鏈 DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特征不同,在相同的部分變性條件下,異源雙鏈因存在錯配區(qū)而更易變性,被色譜柱保留的時間短于同源雙鏈,故先被洗脫下來,從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。由于該技術使用了較高分析靈敏度的色譜技術進行檢測,可快速檢出<5%負荷的變異序列。但需注意的是,由于該技術主要通過異源雙鏈進行序列變異檢測,其不能明顯區(qū)分野生型與變異型的純合子。

(三)高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)

2003年,Wittwer等[19]首次革命性地使用過飽和熒光染料將PCR產物全長進行熒光被動標記,再通過簡單的產物熔解分析對單個堿基變化進行鑒定。該技術的原理也是通過異源雙鏈進行序列變異鑒定。待測樣本經PCR擴增后,若存在序列變異雜合子,則形成異源雙鏈,其熔解溫度大大下降。此時由于雙鏈被飽和染料完全填充,其產物熔解溫度的變化便可通過熔解曲線的差異得以判定。對于變異純合子而言,HRMA也可利用其較高的分辨率完成PCR產物單個位點A:T雙鍵配對與G:C三建配對熱穩(wěn)定性差異的鑒定,但是對于Ⅱ、Ⅲ類SNP的純合子變異則無法有效區(qū)分。

如何利用DNA構象對序列進行推測,從而避免成本較高的序列測定或操作繁瑣的雜交反應一直是分子生物學研究與應用的熱點問題。目前,使用構象變化對序列變異進行間接檢測的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成對變異序列單次閉管的擴增檢測反應。但需要注意的是,由于基于構象變化的分子檢測手段多無法通過探針雜交或核酸序列測定對檢測的特異性進行嚴格的保證,因此其只適合大規(guī)模的初篩,而真正的確診仍需要進行雜交或測序的驗證。

四、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)

相比于其他分子診斷檢測技術,qPCR具有2項優(yōu)勢,即核酸擴增和檢測在同一個封閉體系中通過熒光信號進行,杜絕了PCR后開蓋處理所帶來擴增產物的污染;同時通過動態(tài)監(jiān)測熒光信號,可對低拷貝模板進行定量。正是由于上述技術優(yōu)勢,qPCR已經成為目前臨床基因擴增實驗室接受程度最高的技術,在各類病毒、細菌等病原微生物的鑒定和基因定量檢測、基因多態(tài)性分型、基因突變篩查、基因表達水平監(jiān)控等多種臨床實踐中得到大量應用。但伴隨著qPCR技術的迅猛發(fā)展,有關這項技術的質量管理問題也日益突出,如何消除各類生物學變量所引起的檢測變異,減少或抑制實驗操作與方法學中的各種干擾因素是qPCR技術面臨的難題。

(一)實時熒光定量PCR(real-time PCR)

1.雙鏈摻入法

1992年Higuchi等[20-21]通過在PCR反應液中摻入溴乙錠對每個核酸擴增熱循環(huán)后的熒光強度進行測定,提出了使用熒光強度與熱循環(huán)數(shù)所繪制的核酸擴增曲線,定量反應體系中初始模板的反應動力學(real-time PCR)模型,開創(chuàng)了通過實時閉管檢測熒光信號進行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA雙鏈,且只有嵌入雙鏈時才釋放熒光,在每1次的擴增循環(huán)后檢測反應管的熒光強度,繪制熒光強度-熱循環(huán)數(shù)的S形核酸擴增曲線,以熒光閾值與擴增曲線的交點在擴增循環(huán)數(shù)軸上的投影作為循環(huán)閾值(Cycle threshold,Ct),則Ct與反應體系中所含初始模板數(shù)量呈負指數(shù)關系,推斷初始模板量。隨后Morrison[22]提出了使用高靈敏度的雙鏈染料SYBR Green I進行反應體系中低拷貝模板定量的方法。這一方法操作簡便,但由于僅使用擴增引物的序列啟動核酸擴增,其產物特異性無法得到充分保證。雖然在實時熒光定量PCR反應后可通過熔解曲線對產物特異性進行檢驗,但其特異性明顯遜于使用熒光探針進行檢測,因此雙鏈摻入法并未在臨床實踐中得到認可。

2.Taqman探針

由于雙鏈摻入法存在特異性較低的問題,1996年Heid[23]綜合之前發(fā)現(xiàn)的Taq酶的5'核酸酶活性與熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探針的概念提出了使用Taqman探針進行qPCR的方法。TaqMan探針的本質是FRET寡核苷酸探針,在探針的5'端標記熒光報告基團,3'端標記熒光淬滅基團,利用Taq酶具有5'3'外切酶活性,在PCR過程中水解與靶序列結合的寡核苷酸探針,使熒光基團得以游離,釋放熒光信號。從而使能夠與靶序列雜交的探針在擴增過程中釋放熒光,通過real-time PCR的原理對其進行定量。由于其超高的特異性與成功的商品化推廣,Taqman探針已經成為目前臨床使用最為廣泛的qPCR方法,其在各種病毒基因定量檢測、基因分型、腫瘤相關基因表達檢測等方面具有著不可替代的地位。

3.分子信標

同樣在1996年,Tyagi等[24] 提出了使用分子信標(moleuclar beacons)進行qPCR的方法,分子信標是5'與3'端分別標記有熒光報告基團與淬滅基團的寡核苷酸探針,其兩端具有互補的高GC序列,在qPCR反應液中呈發(fā)夾結構,熒光基團與淬滅基團發(fā)生熒光共振能量轉移(FRET)而保持靜息狀態(tài)。當PCR反應開始后,莖環(huán)結構在變性高溫條件下打開,釋放熒光;在退火過程中,靶序列特異性探針則與模板雜交保持線性,不能與模板雜交的探針則復性為莖環(huán)結構而熒光淬滅,通過檢測qPCR體系中退火時的熒光信號強度,便可以real-time PCR原理特異性檢測體系中的初始模板濃度。相比于Taqman探針,分子信標使用發(fā)卡結構使熒光基團與淬滅基團在空間上緊密結合,大大降低了檢測的熒光背景,其檢測特異性較Taqman探針更高,更適合等位基因的分型檢測。

4.雙雜交探針

1997年,Wittwer等[25]發(fā)表了使用分別標記熒光供體基團與熒光受體基團的2條相鄰寡核苷酸探針進行qPCR的方法。雙雜交探針所標記的供體基團和受體基團的激發(fā)光譜間具有一定重疊,且2條探針與靶核酸的雜交位置應相互鄰近。僅當2條探針與靶基因同時雜交時,供體與受體基因得以接近,從而通過FRET發(fā)生能量傳遞,激發(fā)熒光信號,熒光信號強度與反應體系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2條探針進行靶序列雜交,該方法的特異性比傳統(tǒng)單探針檢測體系得到了極大地提升。

(二)數(shù)字PCR

早在上世紀90年代就出現(xiàn)了使用微流控陣列對單次qPCR反應進行分散檢測的概念?;谶@一理念,Vgelstein與Kinzter[26]于1999年發(fā)表了數(shù)字PCR(digital PCR)的方法,對結腸癌患者糞便中的微量 K-RAS基因突變進行了定量。相比于傳統(tǒng)的qPCR方法,數(shù)字PCR的核心是將qPCR反應進行微球乳糜液化,再將乳糜液分散至芯片的微反應孔中,保證每個反應孔中僅存在≤1個核酸模板。經過PCR后,對每個微反應孔的熒光信號進行檢測,存在靶核酸模板的反應孔會釋放熒光信號,沒有靶模板的反應孔就沒有熒光信號,以此推算出原始溶液中待測核酸的濃度。因此,數(shù)字PCR是1種檢測反應終點熒光信號進行絕對定量的qPCR反應,而非以模板Ct值進行核酸定量的real-time PCR。

經由Quantalife公司開發(fā)(已于2011年被BIO-RAD收購)的微滴式數(shù)字PCR是首款商品化的數(shù)字PCR檢測系統(tǒng),目前已被廣泛運用于微量病原微生物基因檢測、低負荷遺傳序列鑒定、基因拷貝數(shù)變異與單細胞基因表達檢測等多個臨床前沿領域。與傳統(tǒng)qPCR相比較,該技術具有超高的靈敏度與精密度,使其成為目前qPCR領域的新星。

五、對未來5年的展望

半個世紀以來分子診斷的高速發(fā)展離不開分子生物學技術日新月異的進步。概而言之,在過去的50年中分子診斷技術取得了三大轉化與3項提升:即報告信號檢測從放射核素標記向熒光標記轉化,操作方法由手工操作向全自動化轉化,檢測分析通量從單一標志物向高通量多組學聯(lián)合判斷轉化;檢測靈敏度、精密度、特異性的快速提升。

在未來5年中,我國分子診斷事業(yè)將迎來兩方面的進步。隨著衛(wèi)生監(jiān)管部門對分子診斷重要性的認識不斷深入與越來越多高學歷、高素質人才的進入,分子診斷將會出現(xiàn)理念的革命性進步,高通量技術將更多的進入臨床的實際應用中。隨著技術的進一步發(fā)展,傳統(tǒng)針對特定基因異常、病原微生物感染鑒定的方法學,也將在檢測的各項分析性能與操作便捷程度上取得長足的進步。對于傳統(tǒng)人力與時間成本較高的檢測方法學,將出現(xiàn)兩極分化的態(tài)勢,即Southern等經典的檢測金標準將得到保留;而ASO-RDB等靈敏度、特異性均不能滿足實際臨床需求的方法將快速被新型技術所取代。最終,分子診斷也必將一改目前僅僅用于病原微生物基因檢測與部分遺傳性疾病診斷的局面,形成由腫瘤學、遺傳學、微生物學、藥物基因組學四足鼎立,快速發(fā)展的景象。

打開APP閱讀更多精彩內容

聲明:本文內容及配圖由入駐作者撰寫或者入駐合作網(wǎng)站授權轉載。文章觀點僅代表作者本人,不代表電子發(fā)燒友網(wǎng)立場。文章及其配圖僅供工程師學習之用,如有內容圖片侵權或者其他問題,請聯(lián)系本站作侵刪。 侵權投訴

相關文章

芯片

DNA

回顧手機攝像頭的發(fā)展歷程

2021-01-262937

新冠疫情引爆分子診斷市場,2020年全球分子診斷市場將超過150億美元

2020-11-051713

人工智能在分子診斷市場有怎樣的應用

2020-01-16976

帶你了解一下什么是USB 3.1接口

2019-09-237122

AMD經典處理器的發(fā)展歷程

2019-07-135017

分子診斷IVD設備的發(fā)展史

2019-07-088586

Eurofins 收購分子診斷公司TGI,以擴大診斷市場

2019-06-282618

臨界模式下的PFC做一下簡單的推導

2018-09-035093

宏碁智能佛珠了解一下

2018-08-082276

講述Numonyx封裝技術的發(fā)展歷程

2018-06-261947

生物傳感的發(fā)展歷程、熱點及技術挑戰(zhàn)

2018-02-2814045

國產“龍芯”了解及發(fā)展歷程回顧

2012-12-035602

分子診斷速度崛起 醫(yī)療器械企業(yè)競相入場

2012-11-292106

中國鉛酸蓄電池技術發(fā)展歷程

2009-10-29767

印制板制造技術發(fā)展50年的歷程

2006-04-16307

電子發(fā)燒友網(wǎng)

收聽電子行業(yè)動態(tài),搶先知曉半導體行業(yè)

查看

五、dna重組技術發(fā)展歷程?

年份 事 件

1869 F Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。

1944 O.T. Avery證實DNA是遺傳物質。

1952 A.D. Hershey和M.Chase再次證實和噬菌體的遺傳物質是DNA。

1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結構的雙螺旋模型。

M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結構。

1957 A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。

1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留復制模型。

1959-1960 S. Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA,并證明mRNA決定了

蛋白質分子中的氨基酸序列。

1961 Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼;F. Jacob和J. Monod提出了調

節(jié)基因表達的操縱子模型。

1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人證明,多肽鏈上的氨基酸序列與該基

因中的核苷酸序列存在著共線性關系。

1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定;科學家證明細

菌的抗藥性通常由'質粒'DNA所決定。

1966 M.W.Nirenberg,S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯

了全部遺傳密碼。

1970 H.O.Smith,K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內

切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉錄酶。

1972-1973 H.Boyer,P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術,于72年獲得第一

個重組DNA分子,73年完成第一例細菌基因克隆。

1975-1977 F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測定技

術。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。

1978 首次在大腸桿菌中生產由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素。

1980 美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。

1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster獲得轉基因小鼠;A. C. Spradling

和G. M. Rubin得到轉基因果蠅。

1982 美、英批準使用第一例基因工程藥物--胰島素;Sanger等人完成了入

噬菌體48,502bp全序列測定。

1983 獲得第一例轉基因植物。

1984 斯坦福大學獲得關于重組DNA的專利。

1986 GMO首次在環(huán)境中釋放。

1988 J. D. Watson出任'人類基因組計劃'首席科學家。

1989 DuPont公司獲得轉腫瘤基因小氧--'Oncomouse'。

1992 歐共體35個實驗室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定

1994 第一批基因工程西紅柿在美國上市。

1996 完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。

1997 英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。

J.D.Watson 據(jù)說是個表較閑散的人,天天就知道等著喝下午茶,然后就是端裝茶杯到處逛,看別人一天到晚做什么。有一天逛到了在別人的實驗室看到了雙螺旋結構而茅塞頓開,從而打開了人類生命奧秘之門。

六、鐵道工程技術發(fā)展歷程?

高鐵的發(fā)展帶來了生活的便利,如今中國人的出行,高鐵已然成為首選。中國高鐵能夠發(fā)展到如今的盛況,背后經歷了近百年的曲折道路。中國高鐵在百年前是落后于西方國家的,中國發(fā)揮勵精圖治的精神。至今中國高鐵已經長達1.9萬公里,覆蓋全國各大城市,一躍坐上了世界第一的寶座。

鐵路發(fā)展的萌芽

鐵路是連接世界的工具,促進了現(xiàn)代化的交流。鐵路最早興起在工業(yè)革命時代。1830年,以利物浦-曼徹斯特命名的鐵路正式通航,標志著鐵路時代來臨。鐵路的出現(xiàn),縮短了人與人之間的距離,加強了各地人類的交流,遠航成為了觸手可及的事情。

1876年,是中國鐵路發(fā)展最有意義的一年,上海英商怡和洋行修建了中國的第一條鐵路,邁出了中國鐵路發(fā)展的第一步。鐵路是中國前所未有的存在,一經問世便伴隨著許多爭議。

當時中國在晚清政府的統(tǒng)治下,大部分人都認為修建鐵路會減少苦力人口就業(yè)機會,加之當時的中國剛歷經鴉片戰(zhàn)爭后不久,帝國主義的軍事威脅依然存在于世。多方的壓力導致中國鐵路的發(fā)展的步伐暫停。整個80年代,中國鐵路事業(yè)的發(fā)展幾乎處于停滯階段。

中國鐵路的進一步發(fā)展,追溯到了1911年,當時的中國正值辛亥革命,民主黨推翻了清政府的統(tǒng)治,建立了民主共和。新時代的到來,給中國鐵路的發(fā)展帶來了生機,不過五年中國新建鐵路已長達9500公里,這是中國鐵路的巨大飛躍。

中國鐵路盡管已經取得了量的突變,但是對于中國10億的人口來說的,依然處于待發(fā)展的水平。

高鐵時代的到來

新中國成立以后,江提出了減小東西部經濟差距的想法,實施青藏鐵路線成為了計劃的關鍵部分。1999年,中國鐵路開始投入到青藏鐵路的修建計劃中,在鐵路修建規(guī)劃過程中,遇到最大的困難是西藏有著數(shù)以百英里計的凍土地,這給鐵路修建帶來了技術上的難題。

中國人秉持著不懼困難,攻堅難題的精神,將途經格爾木路線確定為最終的方案。經過了長達6年的工期,2006年青藏鐵路全線完工,打破了當時世界上的多項紀錄。

1993年以前,中國鐵路的平均時速僅達到48公里每小時,在高速公路以及航空事業(yè)的競爭壓力下,中國鐵路開始研究如何將時速提高到高速水平。在90年代末終于達成了這一目標,將中國鐵路的速度提高至161公里每小時。

在中國高鐵雛形形成之初,中國政府對此的期待不僅如此,其最終的目標是將鐵路推廣成為人民出行最基礎的交通設備。為了實現(xiàn)這一愿望,中國開始走上建立時速超過兩百公里每小時的鐵路網(wǎng)絡的道路。

與西門子的談判

在新中國成立之初,國內的科學技術不足以支撐鐵路事業(yè)的高速發(fā)展,當務之急是必須引入國外先進技術。2004年,中國政府發(fā)布了一則重要方針,優(yōu)先引進國外技術,實施聯(lián)合發(fā)展的策略,著重打造屬于中國的品牌。致力于創(chuàng)建一條引入外國技術,再進行創(chuàng)新的科技發(fā)展道路。

方案確定之后,中國政府宣布向全世界招標采購。當時參與招標的企業(yè)包含了位于世界高鐵技術發(fā)展高點集團,包括了德國的西門子,法國的阿爾斯通,日本的川崎重工和加拿大的龐巴迪。

中國地大物博,人口眾多,對于任何一個企業(yè)來說都是一塊肥肉,四大企業(yè)都希望借此機會一舉拿下中國市場。當時中國的政策只有一個買主,就是鐵道部。高鐵技術的每一個零件都由鐵道部門代表中國政府統(tǒng)一向制造商下訂單。

當時政府明確地規(guī)定了三個約定,一是外國技術引進中國鐵路市場必須實行關鍵技術的全面轉讓,二是必須使用中國品牌實現(xiàn)本土化生產,三是價格必須合理。當時的德國人根本就沒有把其他公司放在眼里,開出了高額的價格,并且規(guī)定不允許中方進行議價。

因為當時德國西門子的技術比較先進,中方采取議和的態(tài)度,希望西門子能夠將價格降低。經過兩天的談判,至定標前夜,西門子仍然不愿意將價格降低。

西門子面對中方強硬的態(tài)度依然不肯降低價格,令西門子意外的是第二天的招標會上中國選擇了法國作為合作伙伴?;氐降聡?,錯失了與中國合作的西門子談判團體,被集體炒了魷魚,最終導致西門子在中國市場大幅下跌了百分之二十。

如今的中國已經今非昔比,將那些曾經向中國輸出技術的國家,狠狠地甩在了身后。中國的發(fā)展靠的是不畏艱苦,勵精圖治的精神,堪稱時代標桿。

七、信息與通信技術發(fā)展歷程?

信息與通信技術的發(fā)展歷史

(1)最早通信:烽火臺、狼煙;信件:電子通信(電報、電話、網(wǎng)絡信號)

(2)通信中最重要的兩個方面,信息表示、解析方法+信息的傳輸方法

(3)通信雙方事先需要約定好信息的表示方法和解析方法,做到一致,否則信息不能有效傳遞(4)、I信號的傳輸方法是指經過編碼后的通信信息如何在傳輸介質上傳輸?shù)倪^程。

總結:通信過程其實分為3個步驟:首先發(fā)送方先按照信息編碼方式對有效信息進行編碼(編程成可以在通信線路上傳輸?shù)男盘栃螒B(tài)),然后編碼后的信息在傳輸介質上進行傳輸,輸送給接收方;最后接收方接收到編碼信息后進行解碼,解碼后得到可以理解的有效信息。

八、中國高鐵發(fā)展歷程和技術發(fā)展?

中國高鐵的發(fā)展歷經了技術儲備期(2004年之前),技術引進期(2004年~2008年)和自主創(chuàng)新期(2009年至今)。三個時段,對應著中國高鐵堅持原始創(chuàng)新、引進消化吸收再創(chuàng)新以及全面自主創(chuàng)新三階段。

2016年7月,中國政府出臺了新版《中長期鐵路網(wǎng)規(guī)劃》,2025年達到3.8萬公里。不久的未來,這一龐大的高鐵網(wǎng)絡將構建出一個現(xiàn)代國際軌道交通場域,藉此場與出發(fā),中國高鐵的能量也將通過絲綢之路經濟帶將海外項目逐個點亮。

九、科學技術發(fā)展歷程的主要特點?

主要表現(xiàn)在兩個方面:新型的科研組織結構和科研手段、科技信息的公用化。新型科研組織的結構包括:跨學科綜合研究組織結構、矩陣式組織結構、彈性組織結構。

跨學科綜合研究組織結構,是針對綜合性的科技領域、工程技術項目或長期的跨學科的研究任務,把有關的專業(yè)人員集中起來,建立綜合性的研究中心,技術開發(fā)中心,研究院、所或研究室。這種組織形式有利于促進各學科之間的交流、滲透、移植,形成新的觀點、方法與技術,開拓新的技術領域。

矩陣式組織結構,是在傳統(tǒng)的科研組織形式上發(fā)展起來的。傳統(tǒng)的科研組織有兩種形式,即按學科和專業(yè)組織科研機構,以及按產品和任務建立科研機構。矩陣式組織結構打破了傳統(tǒng)的限制,將按學科專業(yè)與按產品任務的建制作綜合考慮,采用縱向與橫向相結合的辦法,處理專業(yè)與任務之間的關系。在科研機構內,根據(jù)學科和專業(yè)建立研究室(組),以利于積累專業(yè)資料,培養(yǎng)專業(yè)人才;在承擔綜合性任務和研制產品時,把不同專業(yè)的人員重新組合,形成專題協(xié)作組。縱向是專業(yè)研究和職能部門的指揮線,橫向是項目研究的指揮線,縱橫交叉形成矩陣。這種形式能較好地適應綜合性的課題任務,有利于出成果、出人才。

現(xiàn)代科研組織的彈性結構,是為了學科發(fā)展的需要和完成不同性質的任務,更充分地發(fā)揮科技人員的創(chuàng)造性,對人員、設備、資金、組織形式等,適時進行調整和組合,為科技人員的合理流動和學術交流創(chuàng)造了條件,以求得科研工作的最大效益。

現(xiàn)代科研工作是以高明新技術實驗設備、檢測計量儀器以及大量的最新科技信息為基礎的。為了提高它們的利用率,就需要實現(xiàn)共用性的科研手段和科技信息的公用性。因此,必須建立各類實驗中心、測試中心、計算中心、數(shù)據(jù)中心、信息中心等開展專項技術服務的組織機構。

十、力諾瑞特信息技術發(fā)展歷程?

力諾瑞特常務副總經理趙培勤認為,企業(yè)之所以能夠實現(xiàn)裂變,主要源于三個方面的原因:一是源于企業(yè)的使命感。20年前,力諾瑞特成立之初,就是為了千家萬戶洗上環(huán)保節(jié)能舒適的熱水澡。經過20年發(fā)展,力諾瑞特全球太陽能銷量累計突破1000萬臺,為無數(shù)家庭帶來健康熱水和舒適享受。近些年,隨著霧霾天氣嚴重和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略提出,國家提出煤改電的減碳排放政策,力諾瑞特緊抓機遇,接連中標北京、天津、河北、山東多省市煤改電項目,為農村清潔采暖做出貢獻。

二是源于企業(yè)創(chuàng)新驅動。力諾瑞特成立之初就與清華大學等合作,成立“光電子研究院”,將太陽能中溫集熱技術產業(yè)化,實現(xiàn)太陽能行業(yè)由熱水向熱能應用的跨越,與上海交大聯(lián)合成立新能源研究院,太陽能與淺層地熱耦合技術榮獲國家科技進步獎,空氣能高效應用技術榮獲國家教育部科技進步一等獎。

三是源于企業(yè)智能制造驅動。力諾瑞特2004年就建成行業(yè)一流的太陽能工廠,2017年建成全自動數(shù)字化機器人智能產線,2018年又建成行業(yè)一流的熱泵的平板工廠,引領太陽能行業(yè)進入“智造”時代。

四是源于品牌等軟實力的支撐。力諾瑞特是行業(yè)領軍品牌,2017年入選國家品牌計劃。員工平均年齡35歲左右,朝氣蓬勃,干事創(chuàng)業(yè)氛圍濃厚。

尚華空乘 - 航空資訊_民航新聞_最新航空動態(tài)資訊
備案號:滇ICP備2021006107號-341 版權所有:蓁成科技(云南)有限公司    網(wǎng)站地圖
本網(wǎng)站文章僅供交流學習,不作為商用,版權歸屬原作者,部分文章推送時未能及時與原作者取得聯(lián)系,若來源標注錯誤或侵犯到您的權益煩請告知,我們將立即刪除。